二酚(CBD)在伴侣动物中具有治疗潜力。短期研究已经确定，犬对CBD的耐受性良好，副作用轻微，碱性磷酸酶(ALP)活性增加。有必要评估CBD的长期耐受性。

  以5和10 mg/kg体重/天的剂量口服给药，确定健康犬对CBD的长期耐受性36周。我们的假设是，犬对CBD的耐受性很好。

  18例健康成年比格犬随机分为3组，每组6例，分别给予0、5、10 mg/kg 体重/天 CBD PO。犬在其住房中适应了3周，并接受了36周的治疗，每天一次食物。每日记录不良事件(AE)。每4周监测一次血液生化特征。数据采用混合模型随时间重复测量分析，显著性设定为α = 0.05。

  0和5 mg/kg 治疗组的粪便评分相似，10 mg/kg治疗组出现软便的频率更高。未发现其他重大不良事件。在接受CBD治疗组中，ALP活性增加(P 0.0001)。其余血液指标均在参考范围内。

  健康犬长期给药5 mg/kg的CBD比10 mg/kg的耐受性更好，两种剂量均引起ALP活性增加。虽然我们的数据没有显示肝损伤，但建议监测长期接受CBD的犬的肝功能。

  二酚(CBD)是(hemp)中发现的150多种非精神药物植物素(PC)中研究最多的一种。二酚有助于治疗炎症和神经系统疾病，通常使用其镇静潜力。大多数CBD研究都是利用啮齿类动物、人类或体外模型进行的，关于犬和猫的科学文献也慢慢的出现。二酚是G蛋白偶联素受体1 (CB1)的非竞争性变构调节剂，也是内源性素系统关键成分CB2的逆激动剂(inverse agonist)。CB1大多分布在在中枢神经系统，调节神经递质释放，而CB2主要位于免疫系统细胞(肠道、扁桃体、脾脏)，起控制细胞因子释放的作用。CBD对这些受体的负调节(negative modulation)有助于体内平衡和炎症的衰减。在哺乳动物中发现与CBD相互作用的其他受体包括脂肪酰胺水解酶(FAAH);G蛋白偶联受体55 (GPR55;骨代谢)，瞬时感受器电位香草酸受体1（TRPV1;镇痛和抗癫痫)，过氧化物酶体增殖物激活受体γ (PPARγ;抗炎和抗氧化)和5-羟色胺受体1和3 (5-HT1A和5-HT3A;抗抑郁和抗焦虑)。

  2018年的《农业法案 Farm Bill》将(0.3% δ -9-四氢酚[THC])从《管制物质法案 Controlled Substances Act》的附表1移至附表2，促进了CBD在犬身上的研究。美国缉毒局(Drug Enforcement Administration，DEA)也于2018年将Epidiolex（一种纯化的CBD溶液）重新分类为五类，其中之一用于儿童癫痫的治疗选择。尽管CBD在人类中的滥用可能性很低，但目前，它通常不被美国食品和药物管理局(FDA)认定为安全(GRAS)的食品添加剂，因此其在犬身上的耐受性和安全性尚未得到充分研究。对犬的短期研究发现，除了大多数犬的碱性磷酸酶(ALP)活性增加外，每天补充4至20 mg/kg体重(BW)的CBD，持续6至12周，耐受性良好。以高达64.7 mg/kg的增量剂量给犬CBD只会导致轻微的不良事件，而给予四氢酚或CBD和四氢酚的联合则会产生可观察到的不良事件。

  CBD的长期安全性直到最近才得到探讨。结论是，犬对CBD的耐受性良好，每天一次，剂量为4 mg/kg体重，持续6.5个月，但会导致ALP活性升高。需要更加多的研究来阐明CBD的长期耐受性，包括探索长期的各种剂量或配方。我们的目标是确定健康成年犬在36周内以2种剂量(5和10 mg/kg体重/天)给予CBD的口服耐受性。我们的假设是，CBD在测试剂量下是耐受性良好的，只会引起ALP活性增加，而不可能会出现肝功能障碍或其他不耐受症状。

  一种含有94.5% CBD、4.6%萜酚(cannabigerol, CBG)、0.3%次二酚(cannabidivarin, CBDV,暂译)和0.6%色原烯(cannabichromene, CBCH,暂译)的工业广谱提取物，在中链甘油三酯(MCT)载剂中含有50和100 mg/mL CBD (KND Labs, LLC;Lakewood Colorado)分别以5和10 mg/kg CBD每日一次来管理。安慰剂配方含有MCT油，不含提取物。最终治疗油的萜烯(terpenes)含量为0.3%，四氢酚未检出(低于0.01%定量限度[LOQ];SC实验室，丹佛，美国)。对重金属、真菌毒素、残留溶剂和农药的质量控制参数进行了评估(科罗拉多州丹佛市SC实验室)，未检测到任何毒素。除联合首席研究员外，所有研究人员对小组分配不知情。在研究开始和结束时(第36周)测试了50和100 mg/mL油的CBD浓度，发现它们是稳定的，没有观察到差异。

  接受同样治疗的犬被分成两例或三例住在一个房间里。所有的犬都被喂食成年犬干犬粮（希尔氏科学饮食成年犬鸡和大麦配方；纽约高露洁棕榄公司），无另外的食物或零食。为了保持健康的体脂指数(BFI)，对每例犬的食物进行预先称重，每两周根据需要调整食物的量。每天07:00 - 09:00在不同的犬窝单独饲喂，在饲喂30分钟内给药CBD或载剂，每天1次，使用3 mL注射器，分次0.1 mL。根据犬的体重每2周调整一次治疗剂量。在为期36周的研究中(第0-2天，第126-128天)，有2例犬在1天内未接受CBD，以进行药代动力学(PK)分析。最后一次PK分析(PK3)如图1所示，但在犬接受最后一次剂量后进行，因此没有遗漏其他CBD剂量。全部提供新鲜水源饮水。包括周末和节假日在内，犬每天都与兽医学生和同一治疗组的其他犬在一个有人工草坪和自然阳光的公共操场上社交。在研究完成和健康数据验证后，所有的犬都被成功地收养到私人家庭。

  在研究开始前，这些犬需要适应它们的住房条件3周。治疗于2021年11月15日(基线)。

  在整个研究期间，所有研究犬每4周进行一次全身体格检查。每次体检时，评估体温、心率、呼吸频率、体重和BFI。此外，还观察了皮肤、眼睛、鼻子、嘴巴和牙齿、心肺、腹部、淋巴结、精神情况和性格、活动水平和发声情况。

  每4周采集一次血液以评估整体健康情况和CBD血浆浓度。餐前从颈静脉采集约10ml血液，按以下方式分管:2ml在紫顶管中(BD Vacutainer K2 EDTA 3.6 mg;BD公司，Franklin Lakes, New Jersey)用于血浆分离(血细胞计数)，3ml在2个红顶管(Monoject无添加剂；Covidien, Dublin, Ireland)用于血清分离(化学和代谢组学)，绿色顶管中2ml (BD Vacutainer钠肝素33 IU；新泽西州BD公司)用于提取血浆(CBD)。按照顺序，给犬喂食，给它们服用相应的油，餐后2小时再次采集血液，测量胆汁酸和血浆CBD浓度。将试管置于冰中，在2000转/min的转速下立即离心10分钟分离血清和血浆（Avanti J-15R离心机；加州贝克曼库尔特公司）。接下来，将代谢组学血清和CBD血浆分别放入2个冷冻管中，保存在-80°C，以备用于将来的工作。

  参数数据在统计分析软件(SAS Institute v 9.4, Cary, North Carolina)中使用广义线性混合模型(GLIMMIX)程序随时间重复测量做多元化的分析。评估的终点包括肝功能指标:ALP、丙氨酸转氨酶(ALT)、天冬氨酸转氨酶(AST)、γ -谷氨酰转移酶(GGT)活性、胆红素、空腹胆汁酸、餐后胆汁酸和白蛋白浓度。剩余的CBC和血液生化变量也使用JMP Pro v17 (SAS Institute Inc.， Cary, North Carolina)做多元化的分析，但未发现显著变化。表S1报告了所有血液变量的平均值和SDs。

  通过在GLIMMIX (SAS v 9.4)中使用选项“plot = student panel”绘制学生化残差面板来评估数据以满足模型假设。ALP残差不符合模型假设，数据来进行自然对数变换，再进行反变换，使用原始比例尺进行报告。基线结果仅作为AST的协变量加入，因为基线治疗之间有差异(P≤0.05)。固定效应包括时间、治疗及其相互作用项，当不显著时从模型中删除(P 0.05)。加入犬窝作为研究对象，将血液生化变量在GLIMMIX随机语句下的协方差结构定义为非结构化(unstructured, UN)。两两治疗比较采用Tukey-Kramer事后检验做调整，以防止I型错误。p值≤0.05被认为是显著的。

  使用JMP Pro 17对从第0周到第36周记录的治疗(0、5和10 mg/kg)中所有异常粪便评分(5、6和7分)采用单卡方检验作为分类(顺序)数据来进行分析。在总体卡方检验中发现了显著性(P 0.05)，并在0和5mg /kg、0和10mg /kg以及5和10mg /kg之间进行了额外的配对卡方检验，以确定治疗差异。

  在研究期间，犬都保持了整体健康，这是通过身体检查、CBC和血液生化来评估的。在试验开始时，7例犬的BFI为20(图2B)，在第12周后，体重开始明显地增加，主要是安慰剂组(P = 0.004;图2 a)。这种变化也体现在对BFI的主观评价上(图2B)，随着研究的深入，接受安慰剂的犬的BFI得分为30的频率更高。

  图 2 在给药0、5和10 mg/kg CBD的36周内，比格犬的体重(平均值±SD) (A)和体脂指数(BFI) (B)。

  体检期间测量的其他连续变量包括体温和心率，在不同治疗之间没有差异(P 0.1)。体检期间测量的变量是正常的，除了检查者的轻微观察，包括轻度淋巴结肿大(0 mg/kg组6例，5 mg/kg组7例，10 mg/kg组5例)，轻度至中度牙菌斑，以及一些与治疗无关的个性和精神状态。

  36周内测量的大多数血液变量都在参考范围内，不受治疗影响，除了ALP活性。碱性磷酸酶活性在第8周后趋于平稳，但在试验结束前的一周内，个体犬的碱性磷酸酶活性仍会发生较大变化。

  治疗本身对ALP活性有显著影响(P 0.0001);其中，服用5和10 mg/kg CBD油的犬的ALP活性总体上高于只给安慰剂的犬(图3，表1)。从第8周到第36周，10 mg/kg组中的一个异常值的ALP活性在935至1511 IU/L之间(比参考范围的高限高出7至10倍)，但在研究结束2周后恢复到非临床相关的活性(ALP = 336 UI/L)。所有治疗的谷丙转氨酶(ALT)均保持在参考范围内(图4;表1)。一例狗在第32周ALT活性增加(同一例犬ALP高)，在第36周降至正常(图4)。5 mg/kg组的天冬氨酸转氨酶活性高于10 mg/kg组，安慰剂组与两个治疗组相似，但所有犬的活性都在参考范围内。白蛋白浓度和GGT活性未进行统计分析，因为数据集中有大量重复值。各组间空腹和餐后胆汁酸浓度无差异(P 1)。对照组中的一个异常值在12周至36周期间餐后胆汁酸浓度增加(从41 μmol/L增加到210 μmol/L)，但在试验结束2周后浓度恢复到正常范围内。

  表1 在36周内长期给药0、5和10 mg/kg CBD的犬的生化变量的最小二乘方平均值[95%置信区间]。

  图 3 连续36周，每天补充10 mg/kg CBD(红色)、5 mg/kg CBD(蓝色)和0 mg/kg CBD(灰色)的犬ALP随时间变化的箱形图。第0天(基线)不包括在统计分析中，但在图表中添加，以显示3个治疗组的起点。ALP的正常参考范围用虚线 IU/L)。

  图 4 连续36周，每天补充10 mg/kg CBD(红色)、5 mg/kg CBD(蓝色)和0 mg/kg CBD(灰色)的犬ALT随时间变化的箱形图。第0天(基线)不包括在统计分析中，但在图表中添加，以显示3个治疗组的起点。ALT的正常参考范围用虚线 不良事件

  最常见的不良事件是胃肠道反应(GI)，所有观察到的不良事件都是轻度的。记录各组软便和腹泻频率的差异(图5)。10 mg/kg CBD油组的犬粪便得分为5、6和7 (Purina粪便评分表)的频率(P 0.01)高于5 mg/kg或安慰剂组的犬。安慰剂组与最低剂量组相似(P 1)。在3周的基线 mg/kg组的犬出现软粪便的频率(粪便评分为5的犬出现13次，粪便评分为6的犬出现10次)也高于5 mg/kg组(粪便评分为5的犬出现4次)和安慰剂组(粪便评分为5的犬出现12次，粪便评分为6的犬出现1次)。具体来说，10 mg/kg CBD油治疗组的一例犬在基线和研究期间出现了更频繁的软便。考虑到这例犬可能对数据有偏差，我们在没有这例犬的数据的情况下重新分析了卡方检验，结论没改变。因此，确定最浓缩的广谱提取物比其他油易产生更软的粪便。

  在研究期间，所有治疗组的不良事件均不止一次发生，包括软便或腹泻(图5)，偶见出现努责或里急后重和呕吐，其中安慰剂组5次，5mg /kg组6次，10mg /kg组8次(加1次反流)。呕吐不太可能与治疗有关，因为它在所有组中都以低频率出现。其他记录的发生率较低且被认为与治疗无关的不良事件包括8例轻度皮肤病事件(0 mg/kg组4例，5 mg/kg组4例)，5 mg/kg组1例异物摄入。

  市场上有许多兽用CBD产品，但科学文献中关于其长期持续耐受性的证据很少。因此，我们的目标是确定长期给药CBD的耐受性，因为它可能用于慢性疾病，如焦虑、骨关节炎和癫痫。由于没确凿的证据说明补充CBD治疗犬的各种疾病的剂量和频率，因此根据先前在犬身上测试的剂量，以及在人类和啮齿动物身上发现的具有抗焦虑和抗惊厥作用的剂量，选择每日剂量为5和10 mg/kg体重。

  以二酚为基础的兽药通常是从(Cannabis sativa)中提取的，其中含有0.3%的干重的精神活性四氢酚(THC)。可以加工成全谱，蒸馏物（或广谱）和CBD分离物。全谱(Full spectrum)是指最低限度加工，含有10%至25% CBD以及100种植物素和其他植物化合物（萜烯，类黄酮，脂肪酸），而蒸馏物是在完全去除四氢酚后产生的，CBD分离物是纯化的粉末形式的CBD。我们的研究中使用了MCT油中的蒸馏萃取物混悬液，因为它包含别的可能增强CBD治疗效果的植物化合物，如萜烯。萜烯是一种芳香化合物，负责浓烈的味道和气味，并认为其与CBD有协同作用，以一种称为随行效应(entourage effect)的现象中增强其效果。这种效应也可能有助于解释为什么植物萃取物往往比分离出来的药物形式更有效。

  在美国和加拿大，中毒的病例主要是由于摄入了为人类配制的含四氢酚的产品，包括食用和干，最常见的临床症状包括尿失禁、定向障碍、共济失调、嗜睡、感觉过敏和心动过缓。一项在犬身上逐步增加CBD、THC: CBD和THC油剂量的安全性研究之后发现，CBD油的单次口服剂量为64.7 mg/kg CBD和2.4 mg/kg THC（比我们研究中最高CBD剂量高6倍以上）诱导的不良反应包括恶心、呕吐、腹泻、嗜睡、感觉过敏、肌肉震颤和共济失调。中度和重度不良事件仅发生在接受THC和CBD:THC油的犬身上。测试短期使用CBD的犬的安全性的研究表明，在2至20 CBD mg/kg/天的广谱提取物的口服中，持续2至12周，没有或只有轻微的不良事件。在我们的研究中，在添加了最高剂量的犬中，唯一注意到的不良事件是软便或腹泻的频率更高，并伴有里急后重和努责。在另一项研究中，腹泻是接受油基CBD萃取物的犬的不良事件，但该研究缺乏阴性对照组，因此无法得出明确的结论。在我们的研究中，开发了两种治疗油，以1±0.2 mL的剂量释放各自的CBD，以便所接受的油的体积大小不会成为混杂因素。此外，我们用统计数据证实，在10 mg/kg组中，倾向于产生软粪便的犬不会对结果产生偏差。因此，100 mg/mL的油可能会引起一些胃肠道不适，因为它的萃取物浓度较高。

  在我们的研究中不进行神经学检查，在一般体格检查和社交过程中也没有发现行为改变。在我们的研究中，犬与工作人员和学生每天都有互动，这可能有助于它们的社会化，但这并没有被量化。通过体重、体脂指数和血液变量监测，采用符合美国饲料控制官员协会(AAFCO)标准的高质量干成年犬粮来控制喂养方案也改善了它们的整体健康情况。在一项类似的长期CBD剂量研究中，评估了“幸福”、“精力充沛”、“运动”、“放松”和“社交”等领域的日常生活品质得分，结果显示对照组和治疗组之间没有差异。在我们的研究中，检查员的观察主要是关于犬的性格，而不是与治疗相关的变化。

  在我们的研究中，控制犬每天喂食的量是为了保持健康的体重。因为一些犬在研究开始时体重过轻，在整个研究过程中出现了积极的体重变化，在试验结束时，一些犬变得稍微超重。体脂指数评分系统还显示，安慰剂组有更多超重的犬。虽然主观评分量表必须谨慎使用，因为它们可能不能反映犬的真实体脂量，安慰剂组的总体平均体重更高，尽管与其他治疗组没有显着差异，这支持了跟主观数据有关。因此，CBD本身可能不会导致体重增加。对体重增加的主要影响是每天以健康为目标提供的食物量，其次是在每天的丰容过程中提供干粮作为奖励，这导致一些犬变得超重。

  最具可比性的CBD长期耐受性研究评估了按年龄、性别和品种平衡的48例犬(包括拉布拉多寻回猎犬、比格犬和诺福克猎犬)每天一次以4mg /kg的CBD蒸馏物给予6个月的效果。本研究还发现ALP活性的增加，在第4周达到稳定。在我们的研究中，我们得知ALP活性一直增加到研究的第二个月，并且观察到具有非常明显时间效应的月度变化。在另一项研究中，平均血清ALP活性仍然略高于参考上限，而在我们的研究中，接受5 mg/kg CBD(每天额外1 mg/kg)的犬在9个月内的平均ALP活性几乎是参考上限的两倍。这可能是不同形式的CBD影响ALP活性。在最近的另一项研究中，每天补充一次5 mg/kg的CBD，持续28天，到试验的最后一天，39例平均ALP活性在100到150 UI/L之间，而在我们的研究中，接受相同CBD剂量的小猎犬在第一个月后的中等水准接近200 UI/L。在之前的研究中，个人会使用了多种混血犬，预计血清ALP活性会因犬种而异。短期研究表明，通常在第四周，给犬服用剂量为4至10 mg/kg/天的CBD，血清ALP活性增加，个体间差异很大。虽然CBD和二酚酸(cannabidiolic acid,CBDA,暂译)以2 mg/kg的剂量组合，每天两次，持续12周，以软咀嚼物给与，会增加ALP活性，但活性并未超过参考上限。因此，ALP活性可能受到CBD给药频率、安慰剂和犬的品种或大小的影响。在我们的研究中，ALP活性存在很大的个体差异。

  碱性磷酸酶是一种细胞膜结合的糖蛋白，其内部携带锌，在碱性条件下催化磷酸单酯水解，但其具体生理功能尚不清楚。在家养动物中描述了四种ALP同功酶：来自骨骼、肠道、肝脏的ALP，以及诱导的ALP。因为ALP不是肝脏特异性的，其单独升高并不表明肝损伤，但肝功能监测很重要，因为发现CBD能抑制和激活人类肝脏中的细胞色素P450酶。服用高剂量CBD (1500 mg/天)约3.5周的人肝脏标记物ALT增加，31%的人升高了5倍的参考上限，达到了药物性肝损伤的国际共识标准。类似剂量的CBD有几率会使犬的肝损伤，但在我们的研究中，5和10 mg/kg体重/天的CBD未曾发现损伤的证据。伴侣动物在大多数情况下要考虑素类型和物种间差异的组合，因为每天两次给予2 mg/kg等量CBD和CBDA PO的猫会出现包括频繁舔舐、摇头在内的不良事件，并且有一例猫在4周后ALT活性增加。在我们的研究中，与高剂量相比，低剂量的CBD对肝酶活性的增加有更好的耐受性，这可以从低剂量组中ALT没有升高得到证明。添加10 mg/kg CBD剂量的犬具有较高的ALP活性，但与5 mg/kg剂量组相比不显著。只有1例雄性犬在第8个月时ALT活性(97 IU/L)高于参考上限(90 IU/L)，研究后2周回到正常状态水平。测量肝脏生物标志物，包括餐前和餐后胆汁酸、AST、GGT和胆红素，在9个月内，接受CBD治疗的组没有犬出现升高。同样，每月CBC和血液生化测定的其他生物标志物也没有显示任何治疗效应。

  在36周的慢性CBD给药过程中，与对照组相比，每天一次补充5 mg/kg CBD的犬出现软便和腹泻的频率相似，血清ALP活性总体增加，但其他肝功能测试没有伴随变化。相反，接受10 mg/kg CBD的犬有更高的异常粪便评分频率，平均ALP活动平均高于低剂量组的犬(但不显著)。我们的数据表明，健康犬长期以每天一次5 mg/kg的剂量给药CBD耐受性良好，使用更高剂量时应谨慎。建议监测肝功能，以确保无另外的不正常的情况发生，特别是当犬有伴随疾病或接受其他药物也由肝脏代谢时。如果肝功能检测结果异常，就应该减少或停用CBD。未来的工作应侧重于在不同的时间间隔长期提供CBD的耐受性，使用不相同的配方(素谱和载剂)，以及不同的犬品种，年龄和大小。