偏头痛作为一种常见的神经系统疾病，目前尚缺乏有效的治疗方法。川芎嗪（Tetramethylpyrazine ,TMP）是从川芎（一种传统的药用食用植物）中提取的主要生物活性成分。本研究旨在通过质谱成像（MSI）分析和分子探索，包括随机森林模型分析、KEGG富集分析和代谢物-代谢物相互作用网络分析，探讨TMP对偏头痛的作用机制。研究结果共鉴定出26种关键代表性的代谢生物标志物，尤其是γ-谷氨酸-半胱氨酸（γ-glu-cys），与谷胱甘肽（glutathione,GSH）代谢紧密关联。MSI发现TMP调节了11种内源性代谢物的丰度，特别是葡萄糖，这是最重要的能量代谢分子，以及GSH的增加，维持了细胞内的氧化还原平衡，这与TMP激活Nrf2信号一致。这些发现为代谢组学与MSI结合在阐释TMP对偏头痛代谢机制的解释提供了洞见，并为TMP在偏头痛健康开发中提供了宝贵的信息。

　　图1展示了实验设计的流程。非靶向代谢组学分析按照图1B所示进行，通过与代谢组学数据库的比较，我们共鉴定出1340种物质（图1C），包括29种脂质及其类似物、267种有机酸及其衍生物、209种有机杂环化合物、184种苯类化合物、98种有机含氧化合物、56种酚丙烷和聚酮类化合物、43种有机氮化合物、25种核苷、核苷酸及其类似物、7种生物碱及其衍生物以及其他化合物，还有150种物质尚未分类。主成分分析（PCA）和正交偏最小二乘判别分析（OPLS-DA，图1D-I）表明，模型组（即处理组）（nitroglycerin ，NTG）与对照组（CON）显著分离，TMP处理的模型组（TMP + NTG）与模型组（NTG）明显不同，并且更接近对照组（CON），这表明NTG组的物质遵循与CON组不同的模式，并且在TMP干预后，代谢物倾向于向CON组靠拢，聚类分析进一步证实了这些结果（图1J）。通过结合P值和代谢物差异的大小，我们可视化了组间代谢物变化的变异性（图1K-L），并通过结合从OPLS-DA模型获得的VIP值筛选了NTG与CON以及TMP + NTG与NTG的差异，分别筛选出46种和41种差异代谢物，详情信息分别列在补充表S3和补充表S4中。

　　图1 川芎嗪（TMP）改善了由引起的代谢紊乱。(A) 实验设计的流程图。(B) 代谢组学分析的流程示意图。(C) 代谢物的分类图。基于三组数据的主成分分析（PCA）得分图在(D)正离子模式和(E)负离子模式下。(F)正离子模式和(G)负离子模式下NTG与CON的正交偏最小二乘判别分析（OPLS-DA）得分图。(H)正离子模式和(I)负离子模式下TMP处理的NTG与NTG的OPLS-DA得分图。(J) 代谢物变化的层次聚类分析热图。(K) NTG与CON的火山图分析，以及(L) TMP处理的NTG与NTG的火山图分析。

　　随后，上述两组差异代谢物通过主成分分析（PCA）、相关性分析和受试者工作特征（ROC）分析进行了分析。根据结果得出， NTG中的差异代谢物与CON明显分离（图2A），样本聚集在一起（图2C），并且ROC曲线E）。而TMP + NTG中的物质与NTG组显著隔离（图2B和D），表明NTG与CON以及TMP + NTG与NTG两组中的差异代谢物都能很好地代表组间差异性。通过聚类分析和多重差异可视化，我们得知这两组差异代谢物大多分布在在苯类化合物、脂质及其类似物、有机酸及其衍生物（图2G-J），这些都涉及到叶酸生物合成和卟啉代谢。此外，NTG组还涉及到类固醇激素生物合成、谷胱甘肽（GSH）代谢、硫辛酸代谢、乙二醇和二羧酸代谢、甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸代谢以及初级胆汁酸生物合成（图2H），而TMP调节的差异代谢物则与半乳糖代谢、神经酰胺脂质代谢、半胱氨酸和甲硫氨酸代谢、色氨酸代谢有关。这些根据结果得出，TMP通过不同的代谢中间体调节了NTG诱导的代谢异常。

　　图2 TMP调节中的差异代谢物。NTG与CON的主成分分析（PCA）得分图（A）以及TMP + NTG与NTG的PCA得分图（B）。NTG与CON的差异代谢物样本相关性分析（C）和TMP + NTG与NTG的差异代谢物样本相关性分析（D）。NTG与CON的受试者工作特征（ROC）分析（E）和TMP + NTG与NTG的ROC分析（F）。NTG与CON的差异代谢物（以ID表示）的差异倍数和聚类热图（G）以及TMP + NTG与NTG的差异代谢物的倍数变化和聚类热图（H）。NTG与CON的KEGG富集分析（I）和TMP + NTG与NTG的KEGG富集分析（J）。

　　为进一步评估川芎嗪（TMP）干预后的代谢物变化，本研究采用集成随机森林模型对潜在的代谢生物标志物进行预测。我们将1340种代谢物进行分类，设置树的数量为500。经过多棵树的迭代，累积的袋外错误率降低至0.2（图3A）。随机森林分类模型中的关键特征显示在图3B。基于平均准确度下降，共有26种关键代表性化合物（表S5），这些化合物能明显提高随机森林分类的准确性，可以被视为TMP给药后的区分性标志物。更重要的是，我们通过构建PCA模型、相关性分析和内部相互作用分析（图3C-E），评估了这26种标志物的性能，结果显示CON组、NTG组和TMP+NTG组在组内聚集，组间分离，表明随机森林模型识别的标志物具有非常出色的预测能力。此外，我们分析了TMP处理后26种潜在标记化合物的谱图（图3F），其中TMP+NTG组中有7种物质的含量与CON一致，这些物质可能是TMP的潜在作用靶点。其中，包括C05377（维生素K3）、C05984（DL-α-羟基丁酸）、C03917（5α-雄甾烷-17β-醇-3-酮）、C00474（木糖醇）、C00836（脯氨酸-色氨酸）、C00669（γ-谷氨酸-半胱氨酸）、C02997（N-乙酰组氨酸）在内的7种物质在TMP处理后含量下降，其结构式显示在图3G，相对含量在图4A中量化。这一点也通过两组之间的相关性分析得到了证实，并且在TMP处理后呈现正相关（图3H-J）。

　　图3 关键代表性代谢物分析。(A) 随机森林模型。(B) 随机森林分类识别的前15种代谢物。(C) 利用PCA可视化潜在标志物。(D)潜在标志物的相关性分析。(E) 潜在标志物的内部相互作用分析。(F)潜在标志物的层次聚类分析热图及NTG与CON、TMP + NTG与NTG之间的差异倍数。(G) 7种潜在标志物的结构式。(H) NTG与CON之间的相关性分析，(I) TMP + NTG与NTG之间的相关性分析，(J) TMP + NTG与CON之间的相关性分析（使用Hiplot (ORG)做多元化的分析）。

　　图4 关键代表性代谢物的富集分析。(A)关键代表性代谢物的相对定量分析。(B) KEGG富集图谱。(C)代谢途径富集信息。(D) 代谢物-代谢物相互作用网络。(E) 代谢途径间的关系。

　　接下来，我们应用KEGG富集分析来识别TMP处理所涉及的代谢途径（图4B和C），这些途径与谷胱甘肽（GSH）代谢、亚油酸代谢、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸的生物合成、醚脂质代谢以及鞘酯代谢有关。同时，我们利用代谢物-代谢物相互作用网络来发现潜在的功能关系（图4E），结果显示与能量代谢紧密关联的物质，如NADP、NADH、辅酶A、ATP和谷氨酸，可能是TMP的潜在作用靶点，它们与GSH代谢密切相关。

　　如图5所示，代表性的MALDI-MSI图像显示了NTG处理的大鼠脑组织中葡萄糖的积累，而川芎嗪（TMP）的给药显著减少了葡萄糖的空间分布。与CON相比，天冬氨酸衍生物如L-天冬氨酰4磷酸、N-乙酰-L-天冬氨酸（NAA）和N-乙酰天冬氨酰谷氨酸（NAAG）在NTG组中减少，这些物质与谷胱甘肽（GSH）的生成呈正相关，而TMP明显逆转了这些物质的变化。此外，TMP明显地增加了脑组织中ATP代谢产物如NAD、ADP、AMP、GMP、腺苷和肌苷的代谢物。这些结果证实，TMP能够将葡萄糖代谢通量调整至正常水平，以维持大脑在对抗与偏头痛相关的氧化应激时的ATP供应。

　　图5 川芎嗪（TMP）在NTG诱导的脑组织中恢复葡萄糖-谷胱甘肽代谢通量。(A) MALDI-MS的工作流程。(B) 选定代谢物的MALDI-MSI图像及结构式，比例尺 = 8毫米。

　　如图6A所示，与CON相比， NTG组的大鼠体重略有下降，而TMP处理的NTG组和IBU（布洛芬）处理的NTG组体重呈现增长趋势，但在实验期间差异不显著。此外，TMP和IBU明显降低了NTG注射后的头部抓挠频率（图6B）。HE染色（图6C）揭示了与NTG组相比，TMP和IBU明显逆转了神经元形态损伤和病理评分，而尼氏染色（图6D）显示TMP和IBU显著逆转了神经元损伤和尼氏体的数量。上述证据说明，TMP不仅缓解了类偏头痛疼痛，还预防了神经元损伤。

　　图6 川芎嗪（TMP）减轻NTG诱导的大鼠类偏头痛行为。(A) 实验期间的体重变化。(B) 每组大鼠头部抓挠的频率。(C) 由三名盲法病理学家确定的HE染色的代表性图像及组织病理学评分。(D) 由ImageJ软件分析的尼氏染色的代表性图像及尼氏体数量。大鼠血清中的谷胱甘肽（GSH）含量（E）、超氧化物歧化酶（SOD）活性（F）、丙二醛（MDA）含量（G）、乳酸脱氢酶（LDH）活性（H）、谷氨酸含量（I）。数值表示为均值 ± 标准误差（n=5），与CON组相比P 0.01，与NTG组相比##⁎⁎P 0.01。

　　接下来，我们对TMP+NTG组诱导的大鼠模型中的抗氧化效应进行了研究。结果显示，与NTG组相比，TMP处理增加了谷胱甘肽（GSH）水平和超氧化物歧化酶（SOD）活性，同时降低了丙二醛（MDA）和谷氨酸含量，并抑制了乳酸脱氢酶（LDH）活性（图6E-I）。而布洛芬（IBU）治疗虽然降低了丙二醛和谷氨酸含量，但对谷胱甘肽、超氧化物歧化酶和乳酸脱氢酶没影响（图6E-I）。

　　同时，在TMP+NTG组大鼠脑组织中，SOD2和GCLC的mRNA水平上调，而nNOS、CAT、NQO1和HO1的表达降低（图7A）。TUNEL实验显示，TMP + NTG组损伤细胞的比例明显低于NTG组（图7B和E）。此外，与NTG组相比，TMP明显促进了GCLC和GCLM的表达（图7C-E），它们是谷胱甘肽（GSH）合成的首批限速酶，并增加了Nrf2及其下游靶标如HO1和NQO1的水平（图7D和E）。咱们进行了皮尔逊相关性分析（图7F-H），以探索26种标志代谢物与包括谷氨酸、Nrf2和GSH在内的3个主要生化指标之间的关联。有必要注意一下的是，大多数代谢物在NTG组中与谷氨酸、Nrf2和GSH呈负相关，而对CON组和TMP+NTG组则表现出正相关，这表明在TMP处理后，相关性趋势正接近CON组。这些证据说明，TMP通过Nrf2信号通路缓解了NTG诱导的大脑氧化应激。

　　偏头痛发病机制中的代谢变化涵盖了多种生化途径，尤其是葡萄糖代谢、氨基酸代谢和脂质代谢，这反映了遗传倾向、环境触发因素和代谢功能障碍之间的动态相互作用。在视觉皮层中葡萄糖的异常积累导致能量输出不足，从而引发细胞内氧化还原失衡，使得偏头痛患者体内的谷胱甘肽（GSH）水平降低，氧化蛋白质产物水平升高。与此同时，我们在细胞膜中观察到乳酸、脂质过氧化和蛋白质羰基化合物的水平升高，这是由于大脑的高能量需求在偏头痛中得不到满足。因此，本研究应用血清代谢组学来寻找偏头痛的生物标志物，使用质谱成像（MSI）分析来揭示大鼠脑组织中的空间局部代谢网络，并通过分子探索来阐明TMP通过靶向能量代谢和氧化应激在偏头痛中的作用。

　　葡萄糖代谢是为大脑细胞提供能量以维持正常神经功能和神经递质通量的基本过程。由N-乙酰组氨酸（N-acetylhistidine）经过转氨和脱羧作用形成的α-酮戊二酸（α-KG），是参与三羧酸（TCA）循环限速步骤的重要分子，在氧化成为琥珀酰辅酶A（succinyl-CoA）过程中消耗NAD和ADP以生成ATP。同时，ADP和AMP之间的转换涉及ATP的产生。重要的是，AMP通过一系列酶促反应从GMP和腺苷生成，但在偏头痛患者中，腺苷和NAD及ADP水平降低，损害了能量合成并加剧了疼痛传递和过敏反应。本研究首次发现偏头痛中N-乙酰组氨酸水平升高，同时脑组织中的ADP、NAD和腺苷表达降低，表明α-KG可能减少，ATP产生下降，而川芎嗪（TMP）显著逆转了这些变化，保持了正常的能量供应。琥珀酸，由琥珀酰辅酶A转化为草酰乙酸的关键代谢物，在偏头痛患者中升高，我们同样在NTG诱导的偏头痛小鼠的血清和三叉神经节组织中也观察到这一现象，可能是对前体琥珀酸半醛水平的负反馈。我们证实了这一假设，发现偏头痛大鼠血清中的琥珀酸半醛增加，揭示了琥珀酸异常积累可能是偏头痛诊断的新生物标志物。随后，首次发现天冬氨酸衍生的代谢物L-天冬氨酸-4-磷酸在NTG诱导的大鼠脑组织中减少，间接反映了天冬氨酸的下调。N-乙酰天冬氨酸（NAA），作为天冬氨酸的另一种衍生物，负责GSH的生成，在偏头痛中与其他所有头痛亚型相比水平较低。N-乙酰天冬氨酸谷氨酸（NAAG）作为NAA到GSH的中间产物，是靶向星形胶质细胞的代谢型谷氨酸受体-3的神经递质，释放神经保护性生长因子，并且是谷氨酸的前体，在偏头痛患者中呈现更高水平。随着NAA和NAAG的下降以及谷氨酸的增加，GSH水平降低，表明偏头痛发作期间发生了氧化应激。与之前的结果一致，TMP处理显著改善了葡萄糖代谢，并随后增加了脑组织中GSH的空间分布，表明葡萄糖代谢的紊乱导致抗氧化剂生成不足，导致偏头痛中的氧化还原失衡，而TMP增强了能量循环以满足大脑的需求。

　　谷氨酸是中枢神经系统中主要的兴奋性神经递质，参与伤害性传递，其调节异常已被认为是偏头痛发作的原因之一。在大脑和外周循环中，谷氨酸水平升高，导致中枢敏化和疼痛刺激，特别是在发作期间。同时，线粒体功能障碍是由谷氨酸兴奋毒性引起的主要事件，它破坏了线粒体分裂和融合的动态平衡，导致线粒体膜电位降低、ATP合成减少和活性氧（ROS）过量产生，最后导致神经元死亡。谷胱甘肽（GSH），作为最重要的内源性抗氧化剂之一，由GCLs催化合成γ-谷氨酰半胱氨酸（γ-glu-cys）产生，包括GCLC和GCLM，它们是具有谷氨酸反馈抑制的限速酶。GSH能直接与自由基反应，通过清除碳自由基、羟自由基、超氧自由基和一氧化氮，帮助维持细胞内的氧化还原平衡。此外，其他两种抗氧化酶，SOD2和CAT，在偏头痛患者中减少。在本研究中川芎嗪（TMP）明显降低了谷氨酸、MDA、LDH、nNOS的水平，并提高了SOD2、γ-谷氨酰半胱氨酸、GCLC、GCLM和GSH的水平，这可能阐明了细胞如何增强了对硝甘油（NTG）注射所诱发氧化应激的抵抗力。此外，Nrf2，作为细胞抗氧化反应的关键转录因子，其转录网络被确定为三叉神经病理性疼痛的治疗靶点。在偏头痛发作期间，氧化应激诱导Nrf2转移到核内，促进GCLC和GCLM的转录激活，这些酶参与GSH的合成。在NTG诱导的偏头痛小鼠的三叉神经尾核中，核内Nrf2的表达及其靶基因，如NQO1和HO1，表达水平上升，以此来抵御氧化性损伤。综合看来，我们的根据结果得出TMP促进了Nrf2及其相关基因表达的激活，皮尔逊相关性分析进一步验证了Nrf2在调节氧化还原稳态中的核心作用。这些证据强烈表明，TMP通过激活Nrf2信号促进了谷氨酸合成谷胱甘肽，展示了其在减轻与偏头痛相关的氧化应激中的关键作用。

　　当前研究探讨了川芎嗪（TMP）缓解偏头痛头痛的有效性。代谢组学研究表明，谷胱甘肽（GSH）代谢、类固醇激素生物合成、硫辛酸代谢途径是偏头痛发病机制的关键，并且我们得知了几种新的内源性代谢物，尤其是琥珀酸半醛和γ-谷氨酰半胱氨酸。TMP的潜在代谢生物标志物与GSH代谢紧密关联，质谱成像（MSI）分析进一步证实了TMP维持葡萄糖代谢通量以供应ATP，并产生抗氧化剂以对抗氧化还原失衡，这可能与其在脑组织中激活Nrf2信号的作用有关。总体而言，本研究为偏头痛的发病机制和TMP的代谢提供了新的见解，这些发现可能为偏头痛患者健康使用TMP提供了科学依据（见图8）。

　　图8 偏头痛中TMP的生物标志物和代谢网络示意图。简而言之，TMP调控的葡萄糖-谷胱甘肽代谢通过激活Nrf2信号通路减轻氧化应激，从而有助于缓解偏头痛中的头痛。

　　【福利时刻】科研服务（点这里就可以看）：、、、、、。咨询加微信：1278317307。